超级基因剪刀是如何打造的?

2020年10月7日,瑞典诺贝尔奖委员会宣布,法国的埃曼纽尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)和美国的詹妮弗·杜德纳(Jennifer A.Doudna)因“开发基因组编辑方法”而获得2020年诺贝尔化学奖,可谓实至名归。不过对于屡屡赢得CRISPR/Cas9技术专利之争的年轻华人科学家张锋来说,此次错失诺贝尔化学奖,则是一大遗憾。

法国埃曼纽尔·卡彭蒂耶和美国詹妮弗·杜德纳获得2020年诺贝尔化学奖。

基因编辑技术是啥

研究发现,单基因突变引起的人类遗传病多达6000种以上,全世界遗传病患者多达3.5亿人,病症相伴一生,甚至早早夺走生命。科学家们一直在寻找解决这一痛苦的终极武器——基因编辑技术,能像word软件编辑文章一样,高效地对基因进行任意修改,从而将致病的突变基因“拨乱反正”,达到根除人类遗传病的目的。

率先实现这一目标的是美国分子生物学家马里奥·卡佩奇(Mario Capecchi)和奥利弗·史密斯(Oliver Smithies)等人。20世纪60年代,卡佩奇和史密斯团队利用DNA复制过程中同源重组的特性,分别独立发明了一种“基因打靶”技术,可用一段正确的DNA片段替代原本发生突变的DNA片段,首次实现了在小鼠基因组上对单个基因进行精准修饰。在之后的二十多年里,基因打靶技术成为一项非常重要的基因修饰技术,科学家用这项技术创造出成千上万种基因敲除小鼠,甚至包括基因敲除猪、羊和牛等大动物,为研究基因功能、阐明遗传病发病机理和开发新的基因疗法等做出了重大贡献。因为这种基因打靶技术是基于英国发育学家马丁·埃文斯(Martin Evans)发明的胚胎干细胞技术,因此这三人一起分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。

不过基于同源重组的基因打靶技术具有明显的缺点,就是效率非常低,往往需要在成千上万个,甚至更多的细胞中才能找到一个基因打靶成功的细胞,因此基因打靶技术只能算作是基因编辑技术的前身。好在科学家总是抵不过好奇心的诱惑和对技术优化的追求,很快就有人从自然界的生命世界里找到了帮手。

上世纪九十年代,来自美国约翰斯·霍普金斯大学的斯里尼瓦桑·钱德拉西格兰(Srinivasan Chandrasegaran)等人发明了一种名为锌指核酸酶的技术。锌指核酸酶包括锌指蛋白和核酸内切酶两个组成部分,前者负责识别基因组DNA中特异序列,后者则负责将DNA切断,利用细胞自身DNA损伤修复功能,实现对目的基因的修饰。由于锌指酶技术能像Word软件编辑文字一样对目的基因进行修改,较之前的同源重组技术大幅提高了基因敲除的效率,从而被称为第一代基因编辑技术,在随后十多年里独领风骚。

不过锌指酶技术并不能对基因组中任何位点进行修改,脱靶效应较高,也就是存在较多的非特异编辑,而且构建成本高且费时费力。到2009年,科学家们又开发出另一种与其类似的基因编辑技术体系,即类转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)技术,是第二代基因编辑技术。该技术只是将识别DNA序列的元件改为TALE 蛋白,核酸内切酶与锌指酶的相同。

锌指酶技术和TALEN技术在实现基因定点修饰上的效率,要比卡佩奇和史密斯等人所发明的基因打靶技术要高1000倍甚至上万倍以上。各种基因编辑的动植物相继被培育出来,基因编辑技术在治疗人类癌症、艾滋病和遗传病等临床应用上也崭露头角。以锌指酶技术和TALEN技术为代表的基因编辑技术被《自然·方法》杂志评为2011年年度技术。

但是,这两种基因编辑技术仍然存在一些重大缺陷,比如它们的DNA识别组件和剪切组件都是蛋白质,其中DNA识别组件需要专业公司,根据客户的各种DNA序列设计和筛选才能获得,过程较为繁琐,而且价格昂贵;另一个缺陷则是脱靶率较高,即存在不同程度的非特异修饰。在治疗人类疾病的临床应用上,这种基因编辑的脱靶将带来致命的后果。

此次帮助法国的埃曼纽尔·卡彭蒂耶和美国的詹妮弗·杜德纳获得诺贝尔化学奖的CRISPR/Cas9技术,则属于第三代基因编辑技术,比较完美地克服了前两种基因编辑技术的缺陷。

两位女科学家的贡献

CRISPR其实是一连串英文单词的首写字母缩写,翻译过来就是“成簇的规律间隔的短回文重复序列”。这是一段特殊的DNA序列,而且是细菌或古细菌用来对付病毒入侵的一种“绝招”。当噬菌体首次入侵细菌或古细菌时,细菌一般拿噬菌体没辙,只能任其在体内为所欲为,但是细菌也进化出一种特殊的本领,它们会将入侵病毒的特殊遗传信息偷偷记录在一段自己的DNA序列中,正是CRISPR。每次复制过程中,细菌的CRISPR会随其他基因序列一起转录成RNA,并开始对整个基因组进行搜索和扫描,当同一类噬菌体再次入侵并释放遗传物质时,细菌的CRISPR能很快识别出这些遗传物质,立即启动免疫防御机制,用随身携带的内切酶将这些病毒的遗传物质给剪个七零八碎,从而清除掉噬菌体。

20世纪80-90年代,日本、西班牙等国家的科学家相继在细菌或古细菌身上发现了间隔重复DNA序列。之后,人们发现在约50%的细菌和90%的古细菌中都含有这种序列。2002年,科学家正式将其命名为CRISPR,并发现一些总是与其结伴而行、具有核酸内切酶功能的蛋白,科学家们将其命名为Cas蛋白。

2007年,美国、法国和加拿大的科学家首次通过嗜热乳酸菌实验证明,CRISPR/Cas系统是细菌防御噬菌体攻击的免疫机制,该成果发表在《科学》杂志上,引起关注。很快,荷兰瓦赫宁根大学研究人员首次证明CRISPR会转录成一段RNA,这段RNA会引导Cas蛋白将入侵的噬菌体基因给剪掉。这时候,CRISPR/Cas系统作为基因编辑工具已经初具雏形。

不过,所谓“玉不琢,不成器”,细菌中的这种天然结构并不能直接用于基因编辑,将CRISPR/Cas系统改造成基因编辑工具的是两位女科学家。法国科学家埃曼纽尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)1968年出生于法国大巴黎社区,1995年在法国巴斯德研究所获得博士学位。之后卡彭蒂耶辗转于法国、美国、瑞典和德国等国家的不同研究机构从事研究和教学工作,主要从事微生物遗传学研究,特别是小RNA。2011年,当时在瑞典于默奥大学任教的卡彭蒂耶带领团队,在国际著名的《自然》杂志发表了她们第一项CRISPR/Cas领域的重磅研究成果。卡彭蒂耶和同事首次发现一段反向编码小RNA对于CRISPR的RNA成熟非常关键,之前人们只是关注基因编辑工具中的蛋白质部分,这项重要研究为CRISPR/Cas工具的改进奠定了基础。

2011年,在波多黎各圣胡安举行的美国微生物学会会议上,卡彭蒂耶遇到了美国加州大学伯克利分校的结构生物学家詹妮弗·杜德纳,两人相谈甚欢。一个侧重于微生物小RNA研究,一个擅长于核酸酶研究,对于CRISPR/Cas工具来说,可谓珠联璧合,于是两人顺理成章地合作起来。杜德纳比卡彭蒂耶年长4岁,1989年在哈佛医学院获得博士学位,先后在耶鲁大学和加州大学伯克利分校担任教授。在遇到卡彭蒂耶之前,杜德纳已经在CRISPR/Cas研究方面颇有建树,发现了与CRISPR相关的一系列核酸内切酶。2012年,杜德纳和卡彭蒂耶在著名的《科学》杂志上发布了她们合作的第一篇论文。在这项研究中,她们给CRISPR加了一个向导RNA,同时挑选Cas蛋白家族排行第九的Cas9作为CRISPR的搭档,并对Cas9蛋白进行了改造,只保留其内切酶功能,使得这一组合的基因编辑效率更高,而且更方便。基因编辑领域的“超级明星”——CRISPR/Cas9就这样横空出世了。

短短几年,CRISPR/Cas技术就成为基因编辑领域绝对的明星,把锌指酶和TALEN技术这两个前辈远远抛在身后,全世界也迅速刮起了基因编辑风暴,席卷整个生命世界。科学家你追我赶地利用CRISPR/Cas技术对细菌、真菌、植物、动物甚至人类细胞和胚胎进行基因编辑操作,研究论文从2012年几十篇飙升至2019年超过5000篇。

杜德纳和卡彭蒂耶也因为在CRISPR/Cas9基因编辑领域的原创发现,一起获得了十多项国际科学大奖,包括2020年的诺贝尔化学奖。不过,另一位在基因编辑技术领域做出重大贡献的华人科学家张锋虽然在关于CRISPR/Cas9专利的竞争中屡屡战胜杜德纳和卡彭蒂耶,却错失了此次诺贝尔化学奖,令人遗憾。

基因编辑工具CRISPR/Cas9原理示意图。

张锋的遗憾

张锋1981年出生于河北省石家庄,11岁时随父母移居美国爱荷华州,2009年在斯坦福大学获得博士学位。博士毕业后,张锋跟随哈佛大学医学院著名遗传学家乔治·丘奇教授从事博士后研究,迅速掌握了锌指酶技术和TALEN技术。不过,张锋发现这两种基因编辑技术并不能令人满意,希望能开发新的基因编辑技术。

张锋赢得CRISPR/Cas9基因编辑专利之争。

2011年初,张锋在麻省理工学院和哈佛大学联合成立的布拉德研究所获得职位,开始独立研究。在旁听一场学术报告时,张锋偶尔听到了CRISPR系统,立刻为之吸引,他敏锐地觉察到CRISPR在基因编辑上的巨大潜力。张锋的目标是利用CRISPR/Cas9工具来改造人类细胞,用于遗传病的基因治疗。经过1年多的努力,到2012年下半年,张锋团队已利用CRISPR/Cas9成功对人类和小鼠细胞的基因进行了精准修饰,而且还能一次性对基因组的多个位点同时进行编辑。这是科学家首次将CRISPR/Cas9技术用于真核生物的基因编辑,该研究成果发表在2013年2月的《科学》杂志上。

在此之前,卡彭蒂耶和杜德纳以及其他两个研究小组只是在非细胞环境或原核生物上进行了类似操作,他们都没能证明这个来自细菌的超级基因编辑工具能否对真核细胞特别是动物或人类细胞管用,而张锋团队率先做到了。

张锋所在麻省理工大学和布拉德研究所在其论文发表之前,申请了CRISPR/Cas技术的发明专利,杜德纳所在的加州大学伯克利分校也于几个月前申请了类似专利。一般情况下,相似的发明内容,谁先申请谁先获得专利权,本来就是半路杀入的张锋有可能在这场专利战中败下阵来。

不过,张锋所在的机构向专利局提交了2011年初他们团队即开展了CRISPR/Cas相关实验的证据,证明自己的研究早于对方。更关键的是,卡彭蒂耶和杜德纳并没有通过实验证明CRISPR/Cas系统能对真核细胞进行基因编辑,这正是张锋专利所要保护的重点。2014年4月,美国专利局决定授予张锋所在团队专利权。卡彭蒂耶和杜德纳团队非常不服气,上诉至法院,经过4年多的鏖战,美国最高法院最终还是判决张锋的专利有效。2020年9月10日,美国专利审判和上诉委员会再次裁定,张锋团队在其已获准的专利中拥有将CRISPR系统用于真核细胞的“优先权”。

公开发表第一篇CRISPR/Cas论文之后,张锋团队再接再厉,不断对CRISPR/Cas技术进行优化,在《自然》《科学》和《细胞》杂志上连续发表数十篇高水平研究论文,成为国际基因编辑技术领域举足轻重的科学家。2018年,37岁的张锋相继当选美国艺术与科学学院院士和美国国家科学院院士,他领导的遗传病基因编辑疗法也已率先进入临床试验。张锋还与卡彭蒂耶和杜德纳共同获得2016年的加拿大盖尔德纳国际奖、2017年的奥尔巴尼医学中心奖和2018年的以色列哈维技术奖,因此张锋获得诺贝尔奖的呼声也很高。此次错失诺贝尔化学奖,对于张锋来说,多少有些遗憾,不过这并不能掩盖其在基因编辑领域的卓越贡献。

南方周末特约撰稿 汤波

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